Historia pewnej zieloności

BioLetyn 20/III/2016

AGATA SZYMANEK

Wyobraź sobie, że jesteś naukowcem. Biologiem, jak wielu innych. I jak wielu innych chciałbyś zrozumieć działanie ludzkiego organizmu. Nie wystarczy Ci jednak wiedza, w jaki sposób porusza się ręką i nogą, ani jaką mękę przechodzi Twoja kanapka, gdy znajdzie się w Twoim układzie trawiennym. Chcesz rozłożyć na części, zrozumieć od podstaw, wniknąć jak najgłębiej w mechanizmy rządzące życiem. Masz nowoczesny mikroskop i widzisz, jak Twoje komórki dzielą się i umierają. Tobie to jednak nie wystarczy. Przecież to tam w środku dzieje się magia! A co gdyby ktoś powiedział Ci, że możesz zobaczyć to wszystko? W dodatku w kolorze i bez wymiany sprzętu na droższy! Czy uwierzysz teraz, że 238 aminokwasów podbiło serca biologów molekularnych?

Dobre lepszego początki

W 1962 roku zespół pod kierownictwem Osamu Shimomure’a opisał jako pierwszy białko emitujące zieloną fluorescencję. GFP (ang. green fluorescent protein) towarzyszy akworynie (ang. aequorin) – białku świecącemu na niebiesko. Odkrycie obu białek było rezultatem badań nad biochemicznymi mechanizmami luminescencji żyjących w Oceanie Spokojnym jamochłonów, a dokładnie meduz Aequorea victoria. W wielkim skrócie eksperyment, na potrzeby którego Shimomure’a wraz z rodziną i współpracownikami zgromadził ponad milion osobników, polegał na wycięciu brzegów pierścieni za pomocą specjalnej maszyny i wyciśnięciu ich przez sztuczny jedwab. Proste, prawda? Kolejnym krokiem było zbadanie składu i właściwości roztworu. Badania ujawniły, że istotny udział w procesie luminescencji A. victoria mają jony wapnia, które wiążą się do akworyny, co prowadzi do emisji niebieskiego światła. Gdzie w tym wszystkim miejsce dla naszego zielonego bohatera? Podczas wiązania niebieskiego białka i Ca2+ luminescencyjna energia akworyny przenoszona jest na białko GFP, przesuwając długość emitowanej fali świetlnej w kierunku światła zielonego. Ot, cała tajemnica.

Ze skali makro do skali mikro

Badacze pochłonięci fascynującym światem podwodnych stworów zapewne w najśmielszych snach nie przypuszczali, jak mocno ich odkrycie wpłynie na ludzi. Być może dlatego pierwsze badania biologii molekularnej z udziałem GFP opublikowane zostały dopiero 30 lat po jego odkryciu – w 1992 roku Douglas Prasher sklonował oraz zsekwencjonował cDNA produkowanego w żywym organizmie białka. Na podstawie wzorców restrykcyjnych klonów zasugerował również istnienie co najmniej trzech genów kodujących GFP. Kwestia finansowania badań naukowych nie zmieniła się tak bardzo w ciągu ostatnich kilku dekad – bolączki wielkich odkrywców niewiele różniły się od problemów dzisiejszych naukowców, dlatego Prasher zmuszony był szukać pomocy u kolegów po fachu. W ten sposób próbki trafiły między innymi do laboratoriów Martina Chalfiego oraz Fredericka Tsujigo. I to był strzał w dziesiątkę!

Już w dwa lata po dokonaniach Prashera, zespół Chalfiego opublikował rezultaty swojej pracy – udało im się doprowadzić do ekspresji sekwencji kodującej GFP po wycięciu kilku początkowych aminokwasów. Ekspresji nie byle jakiej, bo w obcym organizmie! Eschericha coli kolejny raz przysłużyła się naukowcom. Jednakże Tsuji również nie ustawał w wysiłkach, dzięki czemu już miesiąc po doniesieniach Chalfiego, zespół Tsujigo ogłosił na łamach Science, że udało im się dokonać ekspresji zrekombinowanego genu. Co więcej, uzyskane przez naukowców białko zwijało się i świeciło w temperaturze pokojowej, bez udziału dodatkowych czynników pochodzących z meduz. Jak każdy nowy produkt, również ten miał jednak niedoskonałości: był wrażliwy na pH oraz obecność chloru, mało wydajny, fotolabilny i słabo zwijał się w temperaturze 37°C.

Z pomocą przyszła grupa naukowców pod wodzą Remingtona, której udało się poznać strukturę krystaliczną rekombinanta. Miesiąc później grupa Phillipsa opublikowała strukturę naturalnie występującej formy GFP. Dzięki tym dokonaniom możliwe było ulepszenie produktu przez modyfikację reszt aminokwasowych zarówno na drodze ukierunkowanej, jak i losowej mutagenezy.

GFP w służbie biologii

Na czym polega magia małych świecących cząsteczek? W toku badań ekipie Chalfiego udało ustalić się, że gdy gen zastąpiony zostanie sekwencją kodującą GFP, mechanizmy komórkowe, które miały na celu przeprowadzenie ekspresji oryginalnego genu, działają również na wstawionej sekwencji. W efekcie komórka produkuje fluorescencyjne białko, którego świecenie można zaobserwować w niebieskim lub ultrafioletowym świetle. Okazało się jednak, że to nie wszystko! Wystarczy, że sekwencja genu GFP wstawiona zostanie w pobliżu genu kodującego inne białko, to w wyniku ekspresji genów wyprodukowane zostanie białko wyznakowane GFP. Odkrycie to otworzyło drogę do śledzenia ekspresji białek, ich zachowania w komórce, a nawet w całym organizmie – zjawisko wykorzystano między innymi do obserwacji mechanizmu infekcji ludzkich komórek przez wirusa HIV w czasie rzeczywistym. Kolejnym przełomem były osiągnięcia Rogera Tsiena, który postanowił przyjrzeć się bliżej budowie chemicznej świecącego cuda. Poprzez modyfikacje chemiczne udało mu się uzyskać białka emitujące światło o różnej długości fali, dzięki czemu możliwe stało się znakowanie białek znacznie szerszą gamą kolorów. Rozwiązanie to umożliwiło śledzenie wielu białek jednocześnie. Zabawa zaczęła się na dobre.

Białko nie próżnuje

Wprowadzenie fluorescencji do świata biologii molekularnej bezdyskusyjnie zmieniło oblicze tej nauki. GFP od lat ma więc cząsteczki pełne roboty! Jego pojawienie się na biologicznej scenie pozwoliło na znakowanie białek, organelli i innych struktur komórkowych. Dzięki temu możliwa jest obserwacja elementów mniejszych niż rozdzielczość mikroskopu. W efekcie możemy badać lokalizację białek w komórce i jej zmiany, obserwować przemiany komórkowe w czasie podziałów, ekspresję genów, ale też migrację komórek nowotworowych w organizmie.

Białko GFP zdobyło jednak sławę nie tylko w świecie naukowym. Popularna prasa niejednokrotnie donosiła o zwierzętach, w genomie których dokonano modyfikacji prowadzących do ekspresji GFP: głośno było o małpach, świnkach i oczywiście myszach. Największą chyba sławę zdobyły świecące rybki z gatunku Danio rerio. Zbędna ekstrawagancja? O ile fluorescencyjne ryby zwykle stanowią wyłącznie ozdobę salonów, tworzenie transgenicznych, świecących zwierząt ma również inny cel. Transfekcji genu GFP dokonuje się na rozwijającym się zarodku – dzięki temu łatwo można zbadać ścieżkę rozwoju od kilku komórek do dorosłego, wielokomórkowego organizmu.

Nie wszystko złoto, co się świeci…

…czasem może to być też fluorescencyjne białko jamochłona! Mimo że nie jest kamieniem szlachetnym, bez wątpienia przyniosło sławę i majątek niejednemu badaczowi. A trzem z nich również Nagrodę Nobla: w 2008 roku Osamu Shimomura, Martin Chalfie i Roger Tsien wyróżnieni zostali w dziedzinie chemii.

Nie jest to jednak koniec romansu nauki z białkiem zielonej fluorescencji. Badacze nie ustają w wysiłkach, by zmodyfikować i udoskonalić GFP i techniki, w których jest wykorzystywane. Wygląda więc na to, że nie jest to krótka historia miłosna, lecz głęboka fascynacja. A zaczęło się banalnie: coś zaiskrzyło nad brzegiem oceanu…

Źródła bibliograficzne:

Cressey D., Roger Tsien’s legacy: The creations that lit up biology, http://www.nature.com/news/roger-tsien-s-legacy-the-creations-that-lit-up-biology-1.20532?WT.mc_id=FBK_NatureNews [data ostatnich odwiedzin strony: 30.09.2016]
https://en.wikipedia.org/wiki/Green_fluorescent_protein [data ostatnich odwiedzin strony: 30.09.2016]
Sanderson K., Great glowing jellyfish! It’s the Nobel Prize in Chemistry, http://www.nature.com/news/2008/081008/full/news.2008.1159.html [data ostatnich odwiedzin strony: 30.09.2016]
Szwed M., Białko zielonej fluorescencji – nieocenione narzędzie w biologii molekularnej, http://biotechnologia.pl/biotechnologia/artykuly/bialko-zielonej-fluorescencji-nieocenione-narzedzie-w-biologii-molekularnej,12797 [data ostatnich odwiedzin strony: 30.09.2016]
Tsien R., The green fluorescent protein, “Annual Review of Biochemistry”, Vol. 67, s. 509-544, http://www.nature.com/news/2008/081008/full/news.2008.1159.html [data ostatnich odwiedzin strony: 30.09.2016]