W tym stanie się nie pokażę! Bakteryjne stadium VBNC

BioLetyn 21/IV/2016

MAŁGORZATA BEDNARZ

Szacuje się, że obecnie jesteśmy w stanie wyhodować jedynie ok. 1% wszystkich mikroorganizmów. Wiąże się to nie tylko z brakiem odpowiednich podłoży hodowlanych, ale także z wymaganiami środowiskowymi niektórych bakterii. Są one często nieznane lub niemożliwe do stworzenia w warunkach laboratoryjnych. Zdolność do hodowli zależy również od kondycji fizjologicznej danego organizmu. Obecnie dużą uwagę poświęca się diagnostyce bakterii w stanie VBNC i wyjaśnianiu tego zjawiska, gdyż stanowi poważne zagrożenie dla ludzkiego zdrowia, czystości wody pitnej i rekreacyjnej, a także bezpieczeństwa żywności.

Czym jest stan VBNC?

Stadium VBNC (ang. viable but non culturable) to jedna ze strategii adaptacyjnych, którą wiele bakterii wykorzystuje w odpowiedzi na różne, niekorzystne czynniki środowiskowe. Wiąże się ona z obniżeniem aktywności fizjologicznej i metabolicznej komórki, dochodzi również do utraty zdolności do wzrostu na podłożu hodowlanym. Syntetyzowane są tzw. białka głodowe i chaperony, które zwiększają oporność komórki na niesprzyjające warunki. Spada również aktywność respiracyjna i liczba cząsteczek transportowanych przez błonę komórkową na drodze transportu aktywnego. Zmianom ulega również skład błony cytoplazmatycznej, która jest bardziej podatna na uszkodzenia. Dochodzi do zmiany kształtu komórki i jej miniaturyzacji. Mechanizm i droga zmian jest jednak zależna od cech indywidualnych szczepu i rodzaju czynnika stresującego. W przypadku niektórych patogenów może także dojść do utraty zjadliwości, niektóre z komórek wykazują jednak zdolność wirulencji nawet w stanie obniżonej aktywności. Mogą istnieć w ten sposób nawet kilka miesięcy. Co ważne, w momencie zmiany warunków środowiska na korzystniejsze, bakterie odzyskują swoje pierwotne cechy na drodze tzw. resuscytacji. Należy pamiętać, iż stan VBNC nie jest cechą gatunkową, a fizjologiczną danej komórki.

Stan VBNC a warunki środowiska

            Chodząc na basen, pijąc wodę butelkowaną czy stosując antybiotykoterapię, liczymy na to, że wszystkie niebezpieczne bakterie są unieszkodliwione i nie stanowią dla nas zagrożenia. Oczywiście, w wyniku stosowania odpowiednich technik uzdatniania czy prawidłowo przeprowadzonej terapii farmakologicznej, większość mikroorganizmów ginie. Jednak pewne czynniki w specyficznych warunkach indukują u bakterii przejście w stan VBNC, przez co zachowują one swoją aktywność i mogą przetrwać niesprzyjające warunki. Taki efekt odnotowano m.in. w przypadku oddziaływania na komórki wysokiej lub niskiej temperatury, promieniowania UV, głodu, zmian pH, chlorowania, stresu oksydacyjnego czy antybiotyków, szczególnie jeśli pacjent nie zachowuje odpowiedniego dawkowania lub czasu kuracji.

            Zmiana warunków środowiska na korzystniejsze umożliwia resuscytację komórki ze stanu VBNC. Obecność czynników wzrostu, źródła energii oraz odpowiedni stosunek węgla i związków nieorganicznych pozwala odzyskać pierwotne cechy i aktywność u niektórych komórek. Można to uzyskać poprzez sporządzenie odpowiedniego medium, w skład którego wchodzą aminokwasy. W warunkach naturalnych obserwowano to w biofilmach, w których mikroorganizmy, aby wyjść ze stadium VBNC, korzystały z substancji wydzielanych przez inne bakterie, które wykazywały pełną aktywność metaboliczną. Istnieje również możliwość przywrócenia aktywności bakterii w komórkach żywicielskich czy pod wpływem łagodnego wzrostu temperatury. Co ważne, nie u wszystkich komórek, które traktowano powyższymi czynnikami doszło do wyjścia ze stanu „niehodowalności”. Jest to limitowane nie tylko doborem warunków resuscytacji i rodzajem czynnika, który zaindukował stan VBNC, ale także wiekiem i kondycją komórki.

Czy mamy się czego bać?

            Każdy z nas pewnie pomyśli, że bakterie, które wszystkie swoje siły skupiły na takim zmodyfikowaniu struktur, aby zapewnić sobie przetrwanie w niesprzyjających warunkach przy utrzymaniu aktywności, nie stanowią zagrożenia dla człowieka i tak po prostu sobie wegetują w środowisku. Nic bardziej mylnego. Co prawda wiele bakterii patogennych w stanie VBNC traci swą wirulencję bezpowrotnie, jednak część z nich nadal ją zachowuje lub może odtworzyć w przypadku resuscytacji. I tutaj pojawia się problem. Stadium VBNC oznacza brak możliwości wykrycia mikroorganizmów z wykorzystaniem standardowych metod hodowlanych. Prowadzi to do zaniżenia wyniku, który nie odzwierciedla faktycznej liczebności danej grupy bakterii w próbce. Ponadto, część szczepów po wejściu w stan VBNC nabywa oporności na działanie antybiotyków. To zjawisko zaobserwowano np. u gronkowca złocistego Staphylococcus aureus, którego obecność stwierdzono w biofilmie w cewnikach medycznych. Powoduje to nie tylko trudności w diagnozie infekcji, ale także stanowi poważne zagrożenie dla życia i zdrowia człowieka.

            Gdzie możemy spotkać bakterie w stanie VBNC? Wszędzie tam, gdzie są one narażone na działanie szkodliwych dla nich czynników środowiskowych. Często występują w różnego rodzaju biofilmach, próbkach zanieczyszczonej gleby czy w wodzie. W środowisku mogą być zupełnie nieszkodliwe, po dostaniu się do organizmu mogą stanowić jednak poważne niebezpieczeństwo. Wejście w stan VBNC zaobserwowano również u bakterii Escherichia coli (pałeczka okrężnicy) i Pseudomonas aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej), które stanowią potencjalne zagrożenie w wodzie basenowej. Wykazano, iż pomimo stosowania zabiegów uzdatniania wody, w tym chlorowania, nie dochodzi do całkowitego unieszkodliwienia wszystkich mikroorganizmów. Chlorowanie może indukować stan VBNC, przez co bakterie nadal mogą przyczynić się do powstania skażenia, które przy zastosowaniu standardowych procedur analizy mikrobiologicznej nie zawsze może być od razu wykryte.

Nie jesteśmy bezradni

            Chociaż istnienie u bakterii stanu VBNC brzmi groźnie i stanowi nie lada wyzwanie dla diagnostów, nie oznacza to, że jesteśmy bezbronni wobec „niewidzialnych” patogenów. Obecnie rozwija się wiele specyficznych metod detekcji, które umożliwiają stwierdzenie ich obecności. Niestety, często są one kosztowne i mało precyzyjne. Co więcej, nadal nie są znane molekularne podstawy, które decydują o przejściu w stan VBNC, tym bardziej, że są one charakterystyczne dla danego szczepu.

            Podstawowym zadaniem metod jest rozdzielenie puli bakterii na te, które można hodować, a następnie pozostałej grupy na komórki w stadium VBNC i organizmy martwe. W tym celu stosuje się odpowiednio dobrane testy enzymatyczne, na obecność ATP lub opierające się na znacznikach fluorescencyjnych. W przypadku ostatniej z metod wykorzystuje się takie barwniki jak DAPI, oranż akrydyny czy FITC. Wybarwione komórki obserwuje się następnie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Każdy ze stosowanych barwników wykazuje inny mechanizm barwienia. Analizie poddaje się obecność specyficznych dehydrogenaz, ogólną aktywność enzymatyczną mikroorganizmu lub stosunek ilości DNA i białek w komórce.

            Metodami, które wykazują duży potencjał w kierunku rozwoju diagnostyki bakterii VBNC, są techniki molekularne. Polegają one na detekcji mikroorganizmów w oparciu o specyficzne kwasy nukleinowe czy antygeny. Szczególne znaczenie ma PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR, qPCR), który stanowi czułą metodę analityczną. Modyfikacją tej techniki jest jej połączenie z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), co umożliwia odróżnienie komórek żywych i martwych oraz detekcję bakterii w oparciu o mRNA (cząsteczki mRNA są nietrwałe, nie są więc obecne w komórkach martwych). W dodatku analiza związana z wykrywaniem mRNA jest korzystna do oznaczenia bakterii VBNC, gdyż są one aktywne metabolicznie i przeprowadzają transkrypcję, choć w mniejszym stopniu niż komórki nie poddane działaniu czynnika stresowego. Inną z metod jest FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, która wykorzystuje odpowiednio znakowane fluorescencyjnie sekwencje RNA i DNA. Ulegają one hybrydyzacji z komplementarnymi sekwencjami w materiale genetycznym komórek bakterii. W przypadku bakterii VBNC znakowania dokonuje się najczęściej w oparciu o rRNA, które jest skierowane albo w stronę wszystkich komórek bakteryjnych, albo specyficznych szczepów VBNC. Metoda ta jest jednak mniej czuła i nie pozwala na odróżnienie komórki żywej od martwej.

Przechytrzyć bakterie

Stan VBNC zdaje się być idealną strategią na przetrwanie niesprzyjających warunków, szczególnie dla bakterii niezdolnych do tworzenia przetrwalników. Nie może on jednak trwać w nieskończoność – jeśli nie dojdzie do poprawy stanu środowiska, komórki zaczną w końcu obumierać. Problemu nie można jednak bagatelizować. Konieczne jest poznanie i zrozumienie podstaw tego fenomenu – począwszy od mechanizmu powstania po sposób resuscytacji komórek, aby możliwe było dostosowanie metod diagnostycznych do wykrywania zmienionych komórek. Wymaga tego nie tylko ochrona ludzkiego zdrowia, ale także procesy technologiczne wykorzystujące mikroorganizmy.

BIBLIOGRAFIA:

Fakryddin Md., Shahnewaj K., Mannan B., Andrews S., Viable but Nonculturable Bacteria: Food Safety and Public Health Perspective, ISRN Microbiology, 2013.

Li L., Mendis N., Trigui H., Oliver J.D., Faucher S.P., The importance od the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens, Front in Microbiology, 5, 258, 2014.

Olszewska M., Łaniewska-Trokenheim Ł., Odpowiedź bakterii fermentacji mlekowej na stres – stadium VBNC, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość., 5, 90, 15-28, 2013.

Ramamurthy T., Ghosh A., Pazhani G.P., Shinoda S., Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria, Front Public Health, 2, 103, 2014.

http://www.labportal.pl/article/wykrywanie-komorek-bakterii-vbnc-w-srodowisku-wodnym [data ostatnich odwiedzin strony: 1.12.2016]

http://biotechnologia.pl/biotechnologia/artykuly/patogeny-vbnc-nowe-oblicze-infekcji,15921 [data ostatnich odwiedzin strony: 1.12.2016]